一、技術方案
•小鼠血小板表面糖蛋白的流式細胞術分析
•免疫組織化學（采用丙酮固定的冰凍切片）
•免疫沉淀
•免疫印跡（蛋白質印跡分析）
二、小鼠血小板表面糖蛋白的流式細胞術分析
（1）緩沖液和試劑
•Tris 緩沖鹽水 / 肝素（TBS/Hep）：20 mM Tris/HCl；137 mM NaCl；pH 7.3；含 20 U/ml 肝素。
•磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：137 mM NaCl；2.7 mM KCl；1.5 mM KH?PO?；8 mM Na?HPO?；pH 7.14。
•Tyrode's 緩沖液（改良型）：134 mM NaCl；0.34 mM Na?HPO?；2.9 mM KCl；12 mM NaHCO?；20 mM Hepes；pH 7.0；5 mM 葡萄糖；0.35%（w/v）牛血清白蛋白。
•腺苷三磷酸雙磷酸酶（Apyrase）：10 U/ml 儲備液（溶于雙蒸水，-20℃保存）。
•前列環素（前列腺素 I?，PGI?）：1 mM 儲備液（溶于雙蒸水，-20℃保存）。
•CaCl?：1 M 儲備液（溶于雙蒸水）。
（2）稀釋或洗滌全血的制備
1.用肝素化玻璃毛細管（如 ringcap）從眼眶后叢采集 50ul 血液，加入含 200ul TBS / 肝素（20 U/ml）的 1.5 ml 試管中。
2.用 1 ml Tyrode's 緩沖液稀釋，用于流式細胞術分析。
3.若要制備 “洗滌過的血液"：將稀釋血液以 900×g離心 5 分鐘，棄上清，將沉淀重懸于 1.25 ml Tyrode's 緩沖液中。
4.實驗開始前，直接加入 1 mM CaCl?。
注意：對于凝血酶誘導的血小板活化，需去除血漿以避免抗凝血酶活性的干擾。
（3）洗滌小鼠血小板的制備
“洗滌血小板" 的制備耗時更長，但需要更多血液，且所得血小板制品可使用數小時。
1.用 1.5 cm 玻璃毛細管從眼眶后叢采集 0.5–1 ml 血液，加入含 200ul TBS / 肝素（20 U/ml）的 1.5 ml 試管中。
2.樣本以 500×g離心 5 分鐘，將 ** 富含血小板的血漿（PRP）** 轉移至新試管（為回收血小板，需取包含所有紅細胞的完整白色層）。
3.將血小板懸液以 300×g離心 8 分鐘，將無紅細胞的 PRP 轉移至新試管。
4.加入 0.5uM 前列環素（PGI?），以 1300×g離心 5 分鐘。
5.將血小板沉淀重懸于 1 ml Tyrode's 緩沖液，加入 0.02 U/ml 腺苷三磷酸雙磷酸酶和 0.5uM 前列環素，37℃孵育 5 分鐘后，以 1300×g離心。
6.重復步驟 5：將血小板沉淀重懸于 0.5 ml Tyrode's 緩沖液，加入 0.02 U/ml 腺苷三磷酸雙磷酸酶，37℃孵育 30 分鐘。
（4）血小板表面糖蛋白的單色分析
1.將 5ul特異性抗體或陰性對照抗體與 25ul “稀釋全血" 或 “洗滌過的血液" 加入測定管，渦旋振蕩 1–2 秒。
2.室溫孵育 15 分鐘。
3.加入 400ul PBS 終止反應，并在 30 分鐘內完成分析。
（圖示說明：樣本按上述方法與 FITC 偶聯的對照 IgG（黑線）、抗 - GPVI 或抗 - GPV 孵育。通過 “ 前向散射（FSC）/ 側向散射（SSC）特征對血小板設門；設門（R1）血小板的熒光 1（FL1）"強度在單獨直方圖中顯示。RBC：紅細胞。）
（5）血小板活化的雙色分析
1.向測定管中加入 5ul特異性抗體或陰性對照抗體，同時加入 5ul泛血小板標志物。
2.此時可加入小體積（<5ul）額外試劑（如抑制劑）。
3.加入 25ul “稀釋全血"“洗滌過的血液" 或 “洗滌過的血小板（1×10?個）"，渦旋振蕩 1–2 秒。
4.室溫孵育 15 分鐘；加入 400ul PBS 終止反應，并在 30 分鐘內完成分析。
（圖示說明：洗滌后的小鼠血小板與 PBS（靜息組）或凝血酶（0.1 U/ml），以及 FITC 和 PE 偶聯的單克隆抗體（mAbs）共同孵育。通過GPIX 或 GPIIbIIIa 的表達對血小板設門（FL1；gate 1）。）
三、免疫組織化學（采用丙酮固定的冰凍切片）
請注意：不建議對（多）聚甲醛固定的樣本進行免疫染色 —— 因為大多數大鼠抗體在小鼠組織上的染色效果較差。
1.將冰凍組織切片貼于載玻片，4℃下用冰冷的 100% 丙酮固定 20 分鐘；室溫下干燥樣本過夜。
2.為減少試劑用量，可用防水筆在載玻片的組織切片周圍畫 “疏水環"；后續所有步驟中，該環內區域不得干燥，因此建議在濕盒中進行孵育。
3.切片在 PBS 中孵育 20 分鐘。
4.若使用過氧化物酶偶聯的二抗：將切片與 0.03% H?O?在室溫下孵育 10 分鐘（抑制內源性過氧化物酶活性），再用 PBS 沖洗切片 3 次（每次 5 分鐘）。
5.切片在封閉液（二抗宿主物種的血清，用 PBS 按 1:10 或 1:100 稀釋）中室溫孵育 1 小時。
6.用封閉液稀釋的一抗（2–10ug/ml）覆蓋切片，室溫孵育 2 小時。
7.用 PBS 沖洗切片 3 次（每次 5 分鐘）。
8.用熒光團偶聯或過氧化物酶偶聯的二抗（如親和純化的驢抗大鼠 IgG-FITC 或 - HRP，按制造商說明用封閉液稀釋）覆蓋切片，室溫孵育 1 小時。
9.吸去多余液體，用 PBS 沖洗 3 次（每次 5 分鐘）。
10.a）熒光染色的樣本可直接用熒光顯微鏡分析。
11.b）若要顯示 “過氧化物酶標記的結構"：用新鮮制備的3 - 氨基 - 9 - 乙基咔唑（AEC）底物覆蓋切片，孵育至顯微鏡下可見紅色染色（時間 5–30 分鐘不等）；在出現橙色背景染色前，用去離子水沖洗終止反應。如需復染，將樣本與蘇木精孵育 30–240 秒，再用流動溫水沖洗切片 20 分鐘；最后用水性包埋液封片。
四、免疫沉淀
（1）緩沖液和試劑
•PBS/EDTA：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.5 mM KH?PO?，8.0 mM Na?HPO??2H?O，pH 7.3；含 5 mM EDTA。
•IP 緩沖液：40 mM Tris/HCl，0.3 M NaCl，1 mM EDTA，2 mM PMSF，10ug/ml 亮抑酶肽，10ug/ml 抑肽酶，1ug/ml 胃蛋白酶抑制劑。
•Igepal：10% 儲備液（溶于雙蒸水）。
•2×SDS - 樣本緩沖液：10%β- 巰基乙醇（用于還原緩沖液），10% Tris 緩沖液（1.25 M），20% 甘油，4% SDS，0.02% 溴酚藍。
（2）操作步驟
1.洗滌小鼠血小板或細胞（每次免疫沉淀用 1×10?個）3 次：每次用 1 ml PBS/EDTA，5 分鐘，1300×g；然后重懸于 IP 緩沖液。
2.加入 1% Igepal，室溫裂解血小板 15–20 分鐘。
3.以 10,000×g離心 5 分鐘去除細胞碎片，將上清液轉移至新管。
4.加入 20ul“ 洗滌過的蛋白 G 瓊脂糖（PGA）" 進行 “預清除"，4℃孵育至少 3 小時。
5.樣本以 3,000×g離心 5 分鐘；將上清液轉移至新管，加入 “數據表指定濃度的抗體"（通常 2–5ug/ml），30 分鐘后加入 25ul 洗滌過的 PGA；4℃下旋轉孵育至少 2 小時（最好過夜）。
6.洗滌沉淀物：樣本以 3,000×g離心 1 分鐘；向 PGA 沉淀中加入 1 ml 含 1% Igepal 的 1×IP 緩沖液，再以 3,000×g離心 1 分鐘。
7.用 plain IP 緩沖液洗滌 PGA 沉淀 2 次（每次 1 分鐘，3,000×g）。
8.將沉淀重懸于 25ul 1×SDS 樣本緩沖液（還原或非還原型），煮沸 5 分鐘；樣本可冷凍（-20℃）備用，或用于 SDS-PAGE 及后續免疫印跡分析。
五、免疫印跡（蛋白質印跡分析）
（1）緩沖液和試劑
•裂解緩沖液：40 mM Tris/HCl，0.3 M NaCl，1 mM EDTA，0.05% NaN?，1% Igepal。
•PBS：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.5 mM KH?PO?，8.0 mM Na?HPO?·2H?O，pH 7.3。
•PBS-5% 牛奶：含 5% 非脂干奶的 PBS。
•PBST：含 0.1% Tween 20 的 PBS。
•PBST-1% 牛奶：含 1% 非脂干奶的 PBST。
（2）操作步驟（所有步驟可在室溫下進行）
1.用裂解緩沖液制備小鼠血小板或細胞的裂解物，與（2×）SDS 樣本緩沖液在 95℃孵育 5 分鐘。
2.通過 "SDS - 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）"分離蛋白質（還原或非還原條件，依數據表說明），然后將蛋白質轉移至 PVDF 膜。
3.用 PBS-5% 牛奶封閉膜，振蕩孵育1 小時。
4.用含 2–5ug/ml 一抗的 PBST-1% 牛奶孵育膜，振蕩 1 小時。
5.用 PBST 沖洗膜 2 次，再用 PBST 洗滌 2 次（每次 30 分鐘）；洗滌程序可簡化為 “每次 10 分鐘，共 3 次"，但需單獨驗證。
6.用含 HRP 偶聯抗大鼠 IgG 的 PBST-1% 牛奶孵育膜，振蕩 45–60 分鐘。
7.用 PBST 沖洗膜 2 次，再用 PBST 洗滌 2 次（每次 30 分鐘）。
8.用 "ECL（增強化學發光）"顯示結合的抗體。
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